一种用双抗体夹心酶联免疫吸附方法定量检测羊肚菌菌丝,其特征是:利用抗原与抗体特异性结合及酶对底物的显色催化作用,检测羊肚菌菌丝含量。a、是采用双抗体夹心ELISA方法,其中一种抗体为鼠源抗羊肚菌单克隆抗体;b、利用该方法测得羊肚菌菌丝浓度与OD值之间的关系曲线,并且曲线线性相关程度高;c、该方法对羊肚菌菌丝的检测是特异性的检测,作为羊肚菌菌丝的鉴定检测。有益效果是:通过采用双抗体夹心ELISA方法,对羊肚菌菌丝的含量进行快捷、准确地检测,也即掌握了对培养基中羊肚菌的含量这个羊肚菌人工栽培的关键技术,大大地提高了菇农的种植效率,降低了栽培羊肚菌的生产成本与风险。
1.一种用双抗体夹心酶联免疫吸附方法定量检测羊肚菌菌丝的方法,其方法是:选取鼠源抗羊肚菌菌丝的单克隆抗体及兔抗羊肚菌多克隆抗血清,利用抗原与抗体特异性结合及酶对底物的显色催化作用建立定量检测羊肚菌菌丝的双抗体夹心ELISA方法;利用该方法测得羊肚菌菌丝浓度与OD值之间的关系曲线,并且曲线线性相关程度高;且该方法对羊肚菌菌丝的检测是特异性的检测;该方法包括羊肚菌菌丝标准样品的制备,于250ml锥形瓶加入125ml马铃薯培养基,用封口膜封口,灭菌后待用,将4°C保存的羊肚菌菌种斜面置于超净工作台内,无菌操作挑取适量菌丝接种于上述灭菌的马铃薯培养基中,将培养瓶放入恒温振荡培养箱,温度23°C,转速110r/min振荡培养,4天后得到球状羊肚菌菌丝,将培养得到的球状羊肚菌菌丝880×g离心5min,收集沉淀菌丝,经同样的方法用pH7.4的PBS洗涤沉淀菌丝三次,将沉淀菌丝经低温冷冻干燥机冻干24h,得到羊肚菌菌丝冻干品,称取0.31g冻干菌丝,与3g无菌海砂混合,加入适量PBS研磨20min,880×g离心5min,取上清,再经9800×g离心3min,取上清,最后得羊肚菌菌丝标准样品体积为2.35ml,菌丝浓度为1.32×10⁵mg/L,该溶液即为羊肚菌菌丝标准样品。技术领域
本发明属于免疫学检测技术领域,涉及一种羊肚菌菌丝定量检测方法的改进。
背景技术
羊肚菌是一种珍稀的食用菌,以美味著称。近年来的研究发现其具有对人体多方面的保健价值。由于人工栽培技术不成熟,产品基本靠野生资源的采集,价格居高不下。实现羊肚菌的人工栽培具有巨大的商业价值。羊肚菌出菇的物质基础是大量生长的羊肚菌菌丝,可以说羊肚菌菌丝数量的多少是决定了羊肚菌栽培是否能实现出菇的关键因素。因而及时、准确的了解培养基中羊肚菌的含量是羊肚菌人工栽培的关键技术手段。由于目前还没有定量检测羊肚菌菌丝的实验手段与方法,菇农只能用肉眼观察培养基凭经验来判断菌丝的含量,很难做到科学客观了解菌丝含量。酶联免疫吸附试验(简称ELISA)是一种免疫学技术方法,利用抗原与抗体特异性结合及酶对底物的显色催化作用,来检测抗原或抗体的免疫学检测方法,在医学及病原等的检测上有较为成熟的应用。另一种理论上可行的检定羊肚菌菌丝的方法是在实验室条件下的提取羊肚菌样品的DNA,通过RT-PCR测定来推算菌丝含量,该方法的优势是精准,缺点是需要专业的检测实验室,检测周期长(数天),费用昂贵。参考文献:[1]穆晞惠,童朝阳,郝兰群,等.双抗体夹心ELISA法检测相思子毒素[J].细胞与分子免疫学杂志.2007,23(8):763-766.(2)王一东,刘建.一株抗羊肚菌单克隆抗体及其制备方法:中国,200910218152.8[P].2010-06-09.(3)马帅,陈华林,王雅文,等.免疫酶染色法对羊肚菌菌丝特异性靶位的初步定位与分析[J].菌物研究,2014,12(2):115-118。
发明内容
本发明的目的是:提供一种用双抗体夹心酶联免疫吸附方法定量检测羊肚菌菌丝,它可简便、快捷、准确地检测羊肚菌菌丝含量。本发明的技术方案是:利用抗原与抗体特异性结合及酶对底物的显色催化作用,检测羊肚菌菌丝含量。本发明的具体技术方案是:1.是采用双抗体夹心ELISA方法,其中一种抗体为鼠源抗羊肚菌单克隆抗体。2.该方法可以测得羊肚菌菌丝浓度与OD值之间的关系曲线,并且曲线线性相关程度高。3.该方法对羊肚菌菌丝的检测是特异性的检测,可以作为羊肚菌菌丝的鉴定检测。本发明的方法是:酶联免疫吸附试验(简称ELISA)是一种免疫学技术方法,利用抗原与抗体特异性结合及酶对底物的显色催化作用,来检测抗原或抗体的免疫学检测方法,在医学及病原等的检测上有较为成熟的应用。本发明所阐述的检测方法是利用免疫学实验技术的酶联免疫吸附试验双抗体夹心法原理。利用固定在酶标板上的抗羊肚菌抗体,特异性吸附样品中的羊肚菌菌丝抗原,在第二抗体及酶标抗体对抗原特异性结合的基础上,利用酶对底物的催化作用,使底物产生特定波长的颜色物质,底物颜色的深浅与抗体结合的抗原的多少正相关。通过酶标仪可以测得不同量的标准羊肚菌抗原所对应的底物颜色不同深浅(吸光度、也称OD值),建立标准羊肚菌浓度与吸光度对应关系的标准曲线及线性方程,在相同条件下测得样品的吸光度,即可用标准曲线及线性方程求得样品中羊肚菌菌丝的含量。本发明的具体检测方法是:选取合适的鼠源抗羊肚菌菌丝的单克隆抗体及兔抗羊肚菌多克隆抗血清;制备经物理性破碎的液体培养的羊肚菌菌丝标准抗原;在优化反应条件的基础上,建立抗羊肚菌菌丝抗原的双抗体夹心ELISA法;检测不同浓度的标准羊肚菌菌丝样品,建立吸光度(OD值)与菌丝浓度之间的标准曲线及线性方程;在相同工作条件下测待检样本的吸光度值,用标准曲线的线性方程计算得到样品中羊肚菌菌丝的含量值。本发明的有益效果是:通过采用双抗体夹心ELISA方法,对羊肚菌菌丝的含量进行快捷、准确地检测,也即掌握了对培养基中羊肚菌的含量这个羊肚菌人工栽培的关键技术,大大地提高了菇农的种植效率,降低了栽培羊肚菌的生产成本与风险。
附图说明
图1是本发明之包被浓度与OD值间关系曲线图;图2是本发明测得的羊肚菌标准品与OD值标准曲线及线性方程。
具体实施方式
实施例1下面结合附图对本发明做进一步描述:(一)本发明的实施实例所需实验材料与主要仪器设备1.菌株羊肚菌(Morehellaesculenta)菌株(51589号),购于中国农业微生物菌种保藏中心。2检测样本于2012年5月采自吉林市丰满区的野生羊肚菌子实体及其地表下的土壤基质样本(冻存于长春理工大学生命科学技术学院实验室)。3试剂(1)HRP标记山羊抗兔IgG(H+L),HRP标记山羊抗鼠IgG(H+L),购于北京中杉金桥生物技术有限责任公司;(2)TMB,sigma公司;(3)抗羊肚菌单克隆抗体和多克隆抗体鼠抗羊肚菌单克隆抗体(C6A8细胞株、腹水)和兔抗羊肚菌多抗(兔高免血清),由长春理工大学生命科学技术学院实验室制备并保存。其他试剂均为国产分析纯化学试剂。4主要仪器与设备HZQ-QX型恒温振荡培养箱哈东联公司,MDF-192型低温冰箱SANYO公司,FDU1100小型冻干机EYELA公司,ELx800^TM酶标仪美国伯腾仪器有限公司,hiacCF16RX日本日立高速冷冻离心机,等。(二)实施的具体步骤(1)所用抗体效价的测定:用常规间接ELISA法^[8]分别测定抗羊肚菌多抗和单抗的效价,间接ELISA法测得,抗羊肚菌多抗、单抗的效价分别为1:2.05×10⁴和1:2.56×10³。(2)抗羊肚菌单克隆抗体的酶标板包被:将抗羊肚菌的单克隆抗体用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释25ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>、50ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>、100ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>......25600ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>,其蛋白浓度分别为1850mg/L、925mg/L、462mg/L......1.81mg/L包被酶标板,加入200ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>稀释的标准样品(抗原)、200ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>稀释的兔抗羊肚菌多抗、5000ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>稀释的酶标二抗及底物,对抗原进行双抗体夹心ELISA检测,其OD值与包被抗体浓度变化结果见图1。在包被抗体稀释浓度为25600ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>至12800ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>时OD值呈递增趋势,当其稀释浓度高于800ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>时,OD值趋于平稳,故选择最适包被抗体浓度为稀释800ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>,其蛋白浓度为57.88mg/L。(3)标准样品的制备:于250ml锥形瓶加入125ml马铃薯培养基(以下简称PDB),用封口膜封口,灭菌后待用。将4°C保存的羊肚菌菌种斜面置于超净工作台内,无菌操作挑取适量菌丝接种于上述灭菌的PDB中,将培养瓶放入恒温振荡培养箱,温度23°C,转速110r/min振荡培养。约4d后得到球状羊肚菌菌丝。将培养得到的球状羊肚菌菌丝880ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>g离心5min,收集沉淀菌丝,同样的方法用pH7.4的磷酸盐缓冲液(以下简称PBS)洗涤沉淀菌丝三次。将沉淀菌丝经低温冷冻干燥机冻干24h,得到羊肚菌菌丝冻干品。称取0.31g冻干菌丝,与3g无菌海砂混合,加入适量PBS研磨20min,880ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>g离心5min,取上清,再经9800ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>g离心3min,取上清,最后得羊肚菌标准样品体积为2.35ml,菌丝浓度为1.32ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>10⁵mg/L。该溶液即为羊肚菌菌丝标准样品,冷冻或4°C保存,备用。(4)夹心法的初步建立及实验条件的优化:(1)抗体包被:用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液将羊肚菌单克隆抗体(C6A8腹水,蛋白浓度为4.631ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>10⁴mg/L)稀释成蛋白浓度为200mg/L,包被酶标板,每孔加100ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="23"/>,其中一孔不加抗体,作为试剂空白。4°C过夜后甩去包被液,用含有0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液(以下简称PBS-T)洗3次,3min/次,甩干。(2)加待检样品:除试剂空白及另留一列孔作为阴性对照外,其余孔加适当稀释的阳性羊肚菌菌丝标准品各100ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="23"/>,阴性对照孔加100ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="23"/>的PBS-T,37°C孵育1h,用PBS-T洗3次,3min/次,甩干。(3)加兔抗羊肚菌多抗(兔阳性血清,蛋白浓度为1.026ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>10⁵mg/L):除试剂空白孔外,其余各孔加蛋白浓度为500mg/L的兔抗羊肚菌多抗,每孔100ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="23"/>,37°C孵育45min,PBS-T洗5次,3min/次,甩干。(4)加HRP标记的山羊抗兔IgG:所有各孔加1:5000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG,每孔100ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="23"/>,37°C温育45min,洗涤5次,3min/次,甩干。(5)加底物显色液:在各孔中加入新配制的底物显色液100ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="23"/>,37°C避光,显色15min。(6)终止反应:在各个孔中加入2mol/LH₂SO₄溶液50ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="23"/>。(7)检测及实验条件的优化:在ELx800^TM型酶标检测仪上450nm波长处,测定OD值。在阳性、阴性对照成立的基础上,根据不同包被浓度、一抗浓度等对应的OD值进行ELISA夹心法工作条件的优化,在优化了的条件基础上建立ELISA双抗体夹心法。1.2.3ELISA双抗体夹心法工作曲线的建立用已建立的ELISA双抗体夹心法,以标准品为检样分别加入稀释2ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>、4ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>、8ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>、16ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>、32ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>、64ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>、128ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>、256ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>和512ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>的标准样品,以PBS-T做为阴性对照,进行检测。利用Excel办公软件,以标准样品冻干菌丝浓度为横坐标,波长450nm处的OD值为纵坐标作图,获得标准样品菌丝浓度与OD值对应标准曲线及线性方程。(4)利用夹心法得到标准曲线及线性方程:以不同的羊肚菌标准样品干菌丝浓度为横坐标,OD值为纵坐标作图,建立ELISA双抗体夹心法标准羊肚菌菌丝浓度与OD值对应关系的标准曲线。当标准样品菌丝浓度为2.58ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>10²~6.60ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>10⁴mg/L之间时,菌丝浓度对数值与其OD值呈良好的线性关系,见(图2)。对此进行线性回归分析,线性回归方程为y=0.0949x-0.0338,R²=0.9943。(5)待检样品的处理及检测:称取含有羊肚菌菌丝的样本1.02g,与3g海砂混合均匀,加入一定体积的PBS研磨20min。880ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>g离心5min,取上清液,9800ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="14"/>g离心3min,最后得上清1.0ml,该溶液即为土壤基质中菌丝含量检测样本。羊肚菌样本中菌丝含量的测定,根据上述步骤建立的ELISA双抗体夹心法,检测经处理得到的检测样本的OD值,根据标准标准曲线方程、回收率可得出土壤样本中所含菌丝含量数值。